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CCK8/MTT/XTT检测


(a) MTT:

MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料。活细胞在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开裂,生成蓝色的甲月替结晶并沉积在细胞中,甲月替结晶的生成量仅仅与活细胞数目成正比(死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失,不能还原MTT)。还原生成的甲月替结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸钠(PH 4.7)或10%酸化十二甲基磺酸钠(PH 4.7)的溶液中溶解。利用酶标仪测定490nm波长处的光密度测出OD值,即反映活细胞数目。也可利用DMSO(二甲基亚砜)来溶解。用DMSO之前要尽量去掉培养液,一遍DMSO溶解甲月替颗粒,进行比色测定。

 

(b) CCK-8检测细胞增殖(活力):

CCK-8(cell-counting kit-8)检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原,WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。且WST-8相较XTT和MTS化学性状更稳定, 因此实验结果相对更加稳定。此外,WST-8相较MTT、XTT,线性范围相对宽,灵敏度更高。 

当细胞增殖得越多越快,则formazan产生量越多,颜色越深;反之,当内外因造成的细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖(活性)相关数据。

 

(c) XTT:

化学名:2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide,作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的橙黄色产物。当XTT与电子偶合剂(例如PMS)联合应用时,其所产生的水溶性的产物的吸光度与活细胞的数量成正比。用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤,XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物(formazan)。代谢产物在OD450处有吸收峰。

1、使用方便,省去了洗涤细胞;2、检测快速;3、灵敏度高,甚至可以测定较低细胞密度;4、重复性优于MTT。 缺点:XTT水溶液不稳定,需要低温保存或现配现用。

应用范围

mtt检测应用

应用案例

cck8的方法检测PDGF-D对细胞的毒性,本实验采用2个药物浓度,分别作用于细胞24小时、48小时、72小时,然后通过CCK8检测增殖情况,从而反映其药物对细胞的毒性。从表1以及柱状图中了解到药物浓度越大作用细胞时间越长,其细胞的增殖率越大,即药物对细胞的毒性越小。