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病理学检测
免疫组化实验技术对外服务

时间:2020-07-22 16:59:00 浏览:499次


一、免疫组化

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)


二、免疫组化步骤:

1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中,将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys带正电,而大多数的组织带负电荷,从而产生吸附作用。

2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡,先稍微冷却,然后再将待包埋的组织置于石蜡之中,并排列整齐,再将塑料模具盒盖上,最后加入少许液体石蜡,进行冷冻,使石蜡变成固态。

3、切片:将包埋好的组织从模具上取下来,并置于石蜡切片机上,切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致,然后调节切片的厚度,一般为5µm,如果比较难切,则可以适当调整厚度,用毛笔将切割的载玻片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。

4、捞组织:当组织载玻片置于40°C温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走,以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,最好是组织不起皱纹,用载玻片捞组织时,一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张,其中2-3张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差就比较小了,而且捞载玻片的时候最好方向一致,以便观察,再将捞出来的载玻片置于架子上,放入37°C温箱中烘干。
5、脱蜡:依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
6、抗原修复:脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7、血清封闭:冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍(900µlPBS:100µl血清封闭液)。
8、加一抗:将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
9、加二抗:将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
10、加SABC:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍(990µlPBS:10µlSABC)。
11、加显色剂:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀) A:DAB B:H2O2 C:磷酸缓冲液
12、复染:将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。
13、脱水:将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。

14、封片:用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。


结果展示:



威斯腾实验服务流程:


威斯腾生物服务项目

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实时荧光定量PCR 单克隆抗体制备 帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP) 多克隆抗体制备 抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术 Western-blot 实验服务 脊髓损伤模型
生化指标检测 蛋白双向电泳实验服务 脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测 原核蛋白表达纯化 骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP) 真核蛋白表达纯化 心肌缺血模型
GST pull Down ITRAQ定量蛋白质组学 心力衰竭模型
SLAC蛋白组学 肺动脉高血压动物模型
高血压模型
病毒包装纯化 实验课题整体外包 粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化 整体课题外包 大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化 细胞整体实验外包 慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化 动物整体实验外包 过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化 肺炎大鼠模型
肝炎-肝硬化-肝癌模型
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细胞因子芯片 骨髓间充质干细胞培养 胆结石模型
生长因子芯片 脂肪干细胞培养 急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片 心肌成纤维细胞培养 急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片 软骨细胞培养 体内血栓模型
生长因子芯片 血管内皮细胞培养 关节炎模型
炎症因子芯片 神经元细胞培养 I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片 内皮组细胞原代培养 裸鼠成瘤
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HuProt TM 20K人类蛋白组芯片 膜片钳实验
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细胞周期检测 RNA-Seq测序
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Transwell细胞迁移/侵袭 16s扩增子测序 Micro-CT
流式分选 Small RNA测序 小动物活体成像
CCK8/XTT检测 宏基因组测序 核磁共振
台盼蓝检测细胞活性 单细胞测序 PET-CT
药物筛选细胞学实验 circleRNA测序
细胞粘附性检测 甲基化测序 基因编辑动物
细胞划痕实验 条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验 全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理学检测 CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入 基因芯片
扫描电镜 基因定点突变细胞系 LncRNA芯片
透射电镜 单基因敲除细胞系 miRNA芯片
HE染色 多基因敲除细胞系 mRNA芯片
免疫组化 目的基因敲入细胞系 甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测 报告基因敲入细胞系 SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色 CRISPR/Cas9动物敲除/敲入
原位杂交 基因敲除大鼠/小鼠
荧光原位杂交 基因敲入大鼠/小鼠
特殊染色(PSA、茜素红、阿尔新蓝等)
行为学检测 药物筛选服务项目 药效学评价
水迷宫实验 高通量自动药物筛选平台 神经系统药物药效学评价
旷场实验 细胞高内涵药物筛选平台 抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测 蛋白质组学靶标研发平台 心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测 分子药理研究平台 泌尿系统药物药效学评价
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常规药物体外筛选 抗炎免疫药物药效学评价


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